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Jul 31, 2023

As toxinas MenT nucleotidiltransferase estendem as hastes aceitadoras de tRNA e podem ser inibidas pela ligação assimétrica da antitoxina

Nature Communications volume 14, número do artigo: 4644 (2023) Citar este artigo 1087 Acessos 21 Altmetric Metrics detalha Mycobacterium tuberculosis, a bactéria responsável pela tuberculose humana,

Nature Communications volume 14, número do artigo: 4644 (2023) Citar este artigo

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Mycobacterium tuberculosis, a bactéria responsável pela tuberculose humana, tem um genoma que codifica um número notavelmente elevado de sistemas toxina-antitoxina de função amplamente desconhecida. Mostrámos recentemente que o genoma do M. tuberculosis codifica quatro de uma família MenAT generalizada de sistemas toxina-antitoxina nucleotidiltransferase. Neste estudo caracterizamos MenAT1, utilizando sequenciamento de tRNA para demonstrar a atividade de modificação de tRNA MenT1. A atividade MenT1 é bloqueada por MenA1, uma antitoxina proteica curta não relacionada à quinase MenA3. A análise cristalográfica de raios X mostra o bloqueio da dobra conservada de MenT pela ligação assimétrica de MenA1 através de dois protômeros MenT1, formando um complexo heterotrimérico toxina-antitoxina. Finalmente, também demonstramos a modificação do tRNA pela toxina MenT4, indicando atividade conservada em toda a família MenT. Nosso estudo destaca a variação nas preferências de alvo de tRNA pelas toxinas MenT, o uso seletivo de substratos de nucleotídeos e diversos modos de atividade da antitoxina MenA.

Os sistemas toxina-antitoxina (TA) compreendem pequenos módulos genéticos que codificam uma toxina nociva e sua antitoxina antagonista. Eles estão difundidos nos genomas bacterianos e arqueais, e em elementos genéticos móveis, e geralmente são induzidos por estresse . Os sistemas TA desempenham funções na defesa contra a infecção por fagos, na manutenção de regiões genômicas e, em alguns casos, contribuem para a virulência bacteriana e a persistência de antibióticos . Foi demonstrado que sob condições de crescimento tolerantes, a atividade da toxina é bloqueada pela sua antitoxina cognata e o crescimento bacteriano não é afetado. No entanto, sob condições específicas, como infecção por fagos ou perda de plasmídeo, o equilíbrio entre toxinas e antitoxinas é desregulado. Como resultado, as toxinas livres têm como alvo processos ou estruturas celulares essenciais, incluindo tradução, replicação, metabolismo ou envelope celular, causando inibição do crescimento ou morte celular2,10.

Mycobacterium tuberculosis, bactéria responsável pela tuberculose humana, possui um genoma que codifica uma abundância notável de mais de 86 sistemas TA11,12. Este conjunto de sistemas de AT inclui vários exemplos de famílias de AT bem conservadas, que geralmente demonstraram ser induzidas sob condições de estresse relevantes, incluindo hipóxia, engolfamento de macrófagos ou exposição a antibióticos . Muitas das supostas toxinas de M. tuberculosis demonstraram ser tóxicas quando expressas em M. tuberculosis, M. smegmatis e/ou E. coli, enquanto o seu efeito deletério foi eficientemente inibido pela co-expressão da antitoxina correspondente . Consequentemente, foi proposto que as toxinas activadas poderiam modular o crescimento do M. tuberculosis sob certas condições, contribuindo assim para a sobrevivência no hospedeiro humano11,15,16. No entanto, com exceção de alguns sistemas de TA que foram testados e demonstraram contribuir para a infecção do hospedeiro17,18,19, a sua função celular permanece em grande parte desconhecida. Além disso, a natureza altamente tóxica de algumas destas toxinas sugere que os seus mecanismos antibacterianos poderiam ser usados ​​para identificar novos alvos de drogas, ou alternativamente, através da aplicação direta como antimicrobianos intracelulares20,21,22,23,24.

Membros da família MenAT de sistemas TA em M. tuberculosis codificam uma toxina com um domínio proteico semelhante à nucleotidiltransferase (NTase) conservado (DUF1814) e uma antitoxina cognata, que pode pertencer a diferentes famílias de proteínas . Entre os membros da família MenAT de M. tuberculosis, MenT1 (Rv0078A), MenT3 (Rv1045) e MenT4 (Rv2826c) demonstraram inibir o crescimento de M. smegmatis quando superexpressos, enquanto MenT2 (Rv0836c) não mostrou efeito detectável25. As toxinas MenT pertencem à família de proteínas de infecção abortiva (AbiEii) de Streptococcus agalactiae que contém quatro motivos de assinatura conservados . Os motivos N-terminais I e II são encontrados na DNA polimerase β e são propostos para coordenar um íon metálico para ligação e transferência de nucleotídeos. O motivo C-terminal III é semelhante ao das tRNA NTases que adicionam o motivo 3ʹ CCA aos tRNAs imaturos e pode ser importante para o empilhamento de bases com substratos. O motivo C-terminal IV é exclusivo das proteínas DUF1814 e é proposto para formar um sítio catalítico com o motivo III . Até à data, a toxina MenT3 é o membro mais bem caracterizado desta família. Foi demonstrado que MenT3 (também denominado TglT) inibe a tradução transferindo pirimidinas para a extremidade 3' CCA das hastes aceitadoras de tRNA (preferencialmente para Ser-tRNA in vitro), evitando assim maior aminoacilação . Notavelmente, sugeriu-se que tal atividade fosse neutralizada pela antitoxina MenA3 atuando como uma quinase específica que fosforila MenT3 no resíduo do sítio catalítico Ser78 . Este modo de inibição proposto levou à classificação do MenAT3 como um sistema TA tipo VII3,28. As estruturas de raios X de MenT3 e MenT4 mostram que ambas são proteínas globulares monoméricas, bilobadas, com similaridade em sua dobra geral, especialmente em seu suposto sítio ativo25. Além disso, as estruturas da antitoxina MenA4 e do homólogo próximo AbiEi revelam a presença de domínios de ligação ao DNA de hélice-volta-hélice alados N-terminais conectados por um ligante curto aos domínios quinase C-terminais envolvidos na neutralização da toxina . In vivo, demonstrou-se que o menAT2 é induzido após exposição ao estresse nitrosativo e é necessário para a patogênese do M. tuberculosis em cobaias32. Em contraste, praticamente nada se sabe sobre o MenAT1. O sistema MenAT1 codifica a esperada proteína toxina semelhante a NTase MenT1 (compartilhando 15% de identidade de aminoácidos com MenT3) junto com uma suposta antitoxina muito curta de 68 aminoácidos, chamada MenA1, originalmente identificada como uma suposta toxina tipo I semelhante a SymE e prevista ser desordenado e sem domínio de ligação ao DNA12. Trabalhos anteriores mostraram que MenT1 é tóxico quando expresso em M. smegmatis e que sua toxicidade foi eficientemente inibida pelo MenA125 co-superexpresso. Curiosamente, a superexpressão de MenT1 não mostrou toxicidade detectável em E. coli, o que contrasta fortemente com MenT3 ou AbiEii25,33.