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Jun 25, 2023

A restrição conformacional molda a inibição de uma proteína adaptadora de efluxo multidrogas

Nature Communications volume 14, número do artigo: 3900 (2023) Citar este artigo 1884 Acessos 182 Altmetric Metrics detalhes As bombas de efluxo de membrana desempenham um papel importante na resistência bacteriana a múltiplos medicamentos.

Nature Communications volume 14, número do artigo: 3900 (2023) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

As bombas de efluxo de membrana desempenham um papel importante na resistência bacteriana a múltiplos medicamentos. O sistema tripartido de bomba de efluxo multidrogas de Escherichia coli, AcrAB-TolC, é um alvo de inibição para diminuir o desenvolvimento de resistência e restaurar a eficácia antibiótica, com homólogos em outros patógenos ESKAPE. Aqui, racionalizamos um mecanismo de inibição contra a proteína adaptadora periplasmática, AcrA, usando uma combinação de espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério, ensaios de efluxo celular e simulações de dinâmica molecular. Definimos a dinâmica estrutural do AcrA e descobrimos que um inibidor pode infligir estabilização de longo alcance em todos os seus quatro domínios, enquanto um substrato de efluxo em interação tem efeito mínimo. Nossos resultados apoiam um modelo onde um inibidor forma uma cunha molecular dentro de uma fenda entre os domínios lipoil e αβ barril de AcrA, diminuindo sua transmissão conformacional de sinais evocados por drogas de AcrB para TolC. Este trabalho fornece insights moleculares sobre a função da proteína adaptadora multidrogas que pode ser valiosa para o desenvolvimento de terapêutica antimicrobiana.

A resistência a múltiplas drogas refere-se à capacidade dos patógenos bacterianos de sobreviver a doses letais de muitos compostos estruturalmente diversos1. A resistência bacteriana a múltiplos medicamentos continua a espalhar-se a taxas alarmantes, ameaçando a saúde humana a nível mundial. Em 2019, a multirresistência bacteriana causou diretamente 1,27 milhões de mortes em todo o mundo, um número superior ao VIH e à malária juntos2.

Um importante mecanismo de resistência a múltiplas drogas é a atividade das bombas de efluxo3,4. As bombas de efluxo são comumente superexpressas em resposta à exposição a antibióticos e podem exportar uma ampla gama de compostos quimicamente diversos, diminuindo a concentração intracelular de antibióticos e conferindo resistência aos medicamentos1. A família de transportadores de Nodulação e Divisão Celular de Resistência Hidrofóbica e Anfifílica (HAE-RND) desempenha um papel fundamental na resistência bacteriana a múltiplas drogas. Escherichia coli AcrAB-TolC é o membro prototípico desta família com homólogos de outras bactérias ESKAPE gram-negativas5,6,7. É um complexo proteico tripartido que abrange o envelope da membrana de bactérias gram-negativas, onde AcrB é o transportador de membrana interna do complexo, AcrA a proteína adaptadora periplasmática (PAP) da família de proteínas da Proteína de Fusão de Membrana (MFP) e TolC o canal da membrana externa (Fig. 1a). Energizado pela força motriz do próton, o AcrB transporta substratos, incluindo antibióticos, do ambiente intracelular para o exterior da célula, através de um canal selado formado por AcrA e TolC (Fig. 1a)8,9.

um esquema do complexo AcrAB-TolC incorporado no envelope celular. Lipopolissacarídeo LPS. b Estrutura do AcrA isolada de todo o complexo AcrAB-TolC (PDB:5O66)23. c Três construções de AcrA. AcrAL contém Cys25 que é lipidado após a clivagem do peptídeo sinal 1-24. AcrAS contém uma mutação Cys25Met e, portanto, não possui a lipidação e o peptídeo sinal. AcrASD contém duas sequências AcrAS conectadas por um ligante TRRIT. d Caracterização por MS nativa das construções AcrA a pH 6,0. O tampão de proteínas foi trocado por tampão de acetato de amônio 100 mM antes da MS. AcrAL exigiu a presença de 2× concentração micelar crítica (CMC) de DDM a 0,03%. AcrAL apresenta-se como uma mistura de monômeros e dímeros, AcrAS como monômeros e AcrASD como dímero. Os espectros coletados em réplicas biológicas e por dois sistemas MS nativos diferentes, um sistema de tempo de voo e um sistema orbitrap, fornecem confiança de que essas assinaturas espectrais não são artefatos de preparação de proteínas ou detecção de MS . Os envelopes marcados com um asterisco (*) representam o estado de carga mais elevado, indicativo de distúrbio intrínseco. Massas encontradas na Tabela Suplementar 1.

Têm sido feitos esforços para desenvolver inibidores da bomba de efluxo (EPI) contra estes sistemas para “reviver” as actividades de vários antibióticos pré-existentes, aos quais uma população bacteriana se tornou resistente10. Até agora, o foco tem sido gerar EPIs direcionados ao próprio transportador AcrB. No entanto, os EPIs previamente identificados não conseguiram avançar para os ensaios clínicos, devido a problemas de toxicidade e à natureza promíscua do AcrB para transportar os seus inibidores11,12. Assim, há necessidade de explorar outros caminhos na busca pela geração de PAIs bem-sucedidos, com o AcrA emergindo como um alvo potencial para inibição10,13. Recentemente, o NSC 60339 foi identificado como um inibidor de AcrA através de uma triagem experimental-computacional conjunta10. Trabalhos anteriores sugeriram que o NSC 60339 poderia causar uma mudança conformacional no AcrA, e propuseram um possível sítio de ligação na interface entre os domínios lipoil e αβ, denominado sítio IV (Fig. 1b) . Além disso, foi recentemente demonstrado que o AcrA tem funções mais diversas, sendo identificado como um 'necrossinal' bacteriano dentro de enxames de E. coli: quando uma subpopulação do enxame morre, as células mortas liberam o necrossinal AcrA, que se liga ao TolC na parte externa de outros células vivas, estimulando o efluxo dentro da área afetada e a regulação positiva de várias bombas de efluxo16. Curiosamente, trabalhos recentes também mostraram que o NSC 60339 pode inibir a capacidade de necrossinalização mediada por AcrA. Compreender os mecanismos moleculares da inibição da AcrA é, portanto, importante para o futuro EPI e para a descoberta de medicamentos de necrosinalização. No entanto, um mecanismo de inibição da AcrA permanece indefinido.